SYTO 9活細(xì)菌/死細(xì)菌雙染試劑盒產(chǎn)品簡介：

SYTO 9活細(xì)菌/死細(xì)菌雙染試劑盒是一款方便且操作簡單的試劑盒品率，利用SYTO 9綠色核酸染料和碘化丙啶（PI）紅色熒光核酸染料來進(jìn)行細(xì)菌活力的檢測，適用于大量的細(xì)菌種屬對外開放，包括蠟樣芽孢桿菌互動式宣講、枯草芽孢桿菌組建、產(chǎn)氣莢膜桿菌用的舒心、大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌深入交流研討、草分枝桿菌模式、綠膿桿菌、Staphylococcus aureus集聚效應、奧拉尼堡沙門氏菌貢獻、宋內(nèi)志賀氏菌和化膿性鏈球菌。

SYTO 9活細(xì)菌/死細(xì)菌雙染試劑盒的工作原理在于：SYTO 9和PI的光譜特征以及穿透健康細(xì)菌細(xì)胞的能力不同提升。單獨(dú)使用時(shí)持續，SYTO 9能對群體內(nèi)的所有細(xì)菌進(jìn)行標(biāo)記—具有完整膜和受損膜的細(xì)菌；相反，PI只能滲透進(jìn)入受損的膜高品質，PI的插入會引起SYTO 9染色熒光的降低，當(dāng)體系內(nèi)加入兩種染料時(shí)互動講。因此統籌，通過適量比例的SYTO 9和PI的混合染色，具有完整膜結(jié)構(gòu)的細(xì)菌呈綠色熒光支撐能力，而具受損膜結(jié)構(gòu)的細(xì)菌呈紅色熒光產品和服務。兩者染料的最大激發(fā)和發(fā)射波長分別是480/500nm（SYTO 9）和 490/635nm（PI）。背景基本無熒光協同控製。本試劑盒兼容于熒光顯微鏡不斷創新，熒光光度計(jì)、熒光酶標(biāo)儀體驗區、流式細(xì)胞儀或其它熒光檢測儀器更高效。

產(chǎn)品組成：

【注】組分C熒光顯微鏡檢測方法中才會應(yīng)用的到，具體用法見注意事項(xiàng)3)探索。

試劑盒規(guī)格說明（按照建議的試劑稀釋倍數(shù)和單次測試體積來計(jì)算）：保存與運(yùn)輸方法:-20℃避光保存，有效期一年高產。 冰袋運(yùn)輸。

熒光顯微鏡檢測：1ml菌液加入3μl染料混合液（SYTO 1.5μl +PI 1.5μl）快速融入，可做40次獨(dú)立測試帶動產業發展。

熒光酶標(biāo)儀檢測：2ml無菌水加入12μl染料混合液（SYTO 6.0μl +PI 6.0μl），制備成2×工作液發揮作用。按照100μl染料混合液加入100μl菌液的比例使用，可做200次獨(dú)立測試。

流式細(xì)胞儀檢測：2ml菌液加入6μl染料混合液（SYTO 3.0μl +PI 3.0μl）十分落實，可做20次獨(dú)立測試規模。

使用方法(以下步驟僅用作示例以指導(dǎo)科研人員開展自身細(xì)菌樣本的染色。)

一作用、培養(yǎng)條件和細(xì)菌懸液的制備：

【注意】：用本試劑盒進(jìn)行細(xì)菌染色，務(wù)必要小心去除培養(yǎng)基殘留，因?yàn)殂懹泧谕?，核酸和其它培養(yǎng)基成分可能以不可預(yù)料的方式與SYTO 9和PI結(jié)合事關全面，導(dǎo)致染色結(jié)果發(fā)生不可接受的變動。簡單的一次清洗步驟通常足以去除培養(yǎng)基內(nèi)含的培養(yǎng)基成分干擾物殘留製造業。不建議使用磷酸鹽清洗緩沖液發展目標奮鬥，因此可能降低染色效率。

1.1 用營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)大腸桿菌或Staphylococcus aureus（30ml）使其生長至對數(shù)生長后期狀態。

1.2 于10000×g離心10-15min規劃，濃縮25ml細(xì)菌培養(yǎng)物。

1.3 吸走上清液更多的合作機會，用2ml 0.85% NaCl或適當(dāng)緩沖液來重懸沉淀應用前景。

1.4 取1ml重懸菌液分別加入含20ml 0.85% NaCl或適當(dāng)緩沖液的30-40ml離心管（設(shè)置為活細(xì)菌組），用含20ml 70%異丙醇（也可以用其他方法比如高熱處理殺死細(xì)菌）的30-40ml離心管（設(shè)置為死細(xì)菌組）方便。

1.5 兩管樣品（分別為活細(xì)菌組和死細(xì)菌組）于室溫孵育1h明顯，每隔15min顛倒混勻一次。

1.6 兩管樣品（分別為活細(xì)菌組和死細(xì)菌組）于10000×g離心10-15min基石之一。

1.7 用20ml 0.85% NaCl或適當(dāng)緩沖液重懸沉淀基礎上，并且按照步驟1.6再離心一次。

1.8 分別用10ml 0.85% NaCl或適當(dāng)緩沖液重懸兩管樣品行業分類。

1.9 分別取3ml菌液測定670nm的光密度（OD670）預下達，用玻璃或丙烯酸酯比色皿（1cm路徑）。

1.10 對于大腸桿菌或Staphylococcus aureus的建議染色濃度資料，根據(jù)你的儀器類型（熒光顯微鏡自動化、熒光光度經(jīng)、熒光酶標(biāo)儀）或流式細(xì)胞儀來參考相應(yīng)部分的染色條件集成。

二規模最大、染色條件的優(yōu)化：

試劑盒內(nèi)的兩種染料都經(jīng)過平衡優(yōu)化關註度，按照1：1的比例進(jìn)行混合用于絕大多數(shù)的樣本都能得到良好的區(qū)分活/死細(xì)菌。偶然情況下重要手段，兩種染料的混合比例需根據(jù)實(shí)際需求進(jìn)行優(yōu)化調(diào)整穩中求進。比如：在待檢樣本中，綠色熒光太突出不折不扣，建議要么降低SYTO 9濃度再獲，要么提高PI濃度。

為了全面優(yōu)化染色條件最深厚的底氣，建議測試梯度濃度的SYTO 9敢於挑戰，每一種濃度與梯度濃度的PI進(jìn)行組合染色。建議按照1ml細(xì)菌懸液加入3µl不同混合比率的染料預(yù)混液應用擴展。

[注]：SYTO 9 +PI 對細(xì)菌的染色請按照說明書建議的15min來操作過程中，不要超過30min。 SYTO 9有很好的細(xì)菌滲透性積極，我們給的實(shí)驗(yàn)條件都是優(yōu)化過大數據。 SYTO 9只有在哺乳動物細(xì)胞染色前景，可能會延長染色時(shí)間到120min經驗。

由于染的是活菌+死菌的比例，請染色后盡快觀察長效機製，不要超過1h進一步意見。 另，染色后基本是不用清洗的等地，除非覺得背景熒光很高產業，就是非細(xì)菌的菌體部分都能看到熒光，才有必要簡單清洗一次共享應用。

三工具、熒光顯微鏡操作步驟：

活菌和死菌的熒光可能用標(biāo)準(zhǔn)的熒光素長通濾片設(shè)置來同時(shí)觀察。替代方案的話情況較常見，活菌（綠色熒光）和死菌（紅色熒光）可分別用熒光素和Texas Red帶通濾光片設(shè)置市場開拓。用于本試劑盒檢測的建議熒光顯微鏡濾片設(shè)置見表1。

表1 適用于本試劑盒檢測用的常見濾光片特征：

3.1 在微量離心管內(nèi)組合等量的組分A（SYTO 9）和組分B（PI）講道理，混勻引領。

3.2 每1ml細(xì)菌懸液內(nèi)加入3μl染料預(yù)混液。按照建議的稀釋倍數(shù)更加廣闊，最終得到的染色工作液內(nèi)含0.3% DMSO優化服務策略。更高濃度的DMSO可能對染色產(chǎn)生副效果技術先進。

3.3 混勻后室溫避光孵育15min。

3.4 吸5μl染色的細(xì)菌懸液到載玻片上技術節能，并蓋上18mm方形蓋玻片數字化。

3.5 根據(jù)表1選擇熒光顯微鏡上合適的濾片來觀察。

四作用、熒光光度計(jì)操作步驟：

4.1 調(diào)整大腸桿菌懸液（活和殺死）使其密度為1×108個(gè)細(xì)菌/ml（~0.03 OD670）或Staphylococcus aureus懸液（活和殺死）使其密度為1×107個(gè)細(xì)菌/ml（~0.15 OD670）開展攻關合作。用于熒光光度計(jì)檢測，Staphylococcus aureus懸液的濃度通常比大腸桿菌少10倍。

4.2 參考表2在1cm 玻璃情況正常、丙烯酸酯或石英熒光比色皿混勻五種不同比例的細(xì)菌懸液。每個(gè)樣本的總體積為3ml聯動。

4.3 在微量離心管內(nèi)分別加30μl組分A（SYTO 9）和30μl組分B（PI）各領域，混勻。

4.4 每組不同比例的細(xì)菌懸液內(nèi)加入9μl染料預(yù)混液（5個(gè)樣本×9μl =45μl總量）技術特點，用槍上下吹打數(shù)次使其混勻的有效手段。

4.5 室溫避光孵育15min。

4.6 熒光測定和數(shù)據(jù)分析：

①用熒光光度計(jì)測定每組細(xì)菌懸液（Fcell）的熒光發(fā)射光譜（激發(fā)：470nm保持競爭優勢，發(fā)射：490-700nm）

②分別測定發(fā)射光譜在510-540nm（em1真正做到，綠色）和620-650nm（em2，紅色）的累積熒光方案，并計(jì)算累積熒光比值：RatioG/R=Fcell,em1/Fcell,em2

③以大腸桿菌懸液內(nèi)活細(xì)胞的占比為橫坐標(biāo)追求卓越，以累積綠色熒光與紅色熒光比（RatioG/R）為縱坐標(biāo)，制圖

五創新延展、熒光酶標(biāo)儀操作步驟：

針對細(xì)菌懸液性能，用熒光酶標(biāo)儀的測定條件與熒光光度計(jì)的基本類似。如同熒光光度計(jì)的檢測步驟長效機製，染料濃度相同于熒光顯微鏡的建議濃度支撐能力，綠/紅熒光比與活細(xì)菌相對數(shù)量呈正比。

5.1 調(diào)整大腸桿菌懸液（活和殺死）使其密度為2×108個(gè)細(xì)菌/ml（~0.06 OD670）或Staphylococcus aureus懸液（活和殺死）使其密度為2×107個(gè)細(xì)菌/ml（~0.3 OD670）像一棵樹。用于熒光酶標(biāo)儀檢測協同控製，Staphylococcus aureus懸液的濃度通常比大腸桿菌少10倍。

5.2 參考表3在16×125mm高硼硅玻璃培養(yǎng)管內(nèi)混勻五種不同比例的細(xì)菌懸液（大腸桿菌或Staphylococcus aureus）有效保障。每個(gè)樣本的總體積為2ml激發創作。

5.3 在微量離心管內(nèi)分別加6μl組分A（SYTO 9）和6μl組分B（PI），混勻稍有不慎。

5.4 通過將所有的12μl上述預(yù)混液加入2ml無菌的dH2O探索，混勻后制備2×染色混合液。

5.5 吸100μl細(xì)菌懸液混合物到平底96孔板的各孔內(nèi)，建議每個(gè)制備物做三個(gè)平行重要作用。96孔板的邊緣孔通硤猿窒刃?？罩靡员苊饧僮x數(shù)。

5.6 更換新的槍頭增幅最大，每孔加入100μl 2×染色混合液具體而言，上下吹打使充分混勻。

5.7 室溫避光孵育15min滿意度。

5.8 熒光測定和數(shù)據(jù)分析：

①以~485nm為激發(fā)波長奮戰不懈，~530nm為發(fā)射波長（emission 1，綠色）來測定每孔熒光

②以~485nm為激發(fā)波長智慧與合力，~630nm為發(fā)射波長（emission 2規定，紅色）來測定每孔熒光

③通過測定兩種發(fā)射波長下的熒光強(qiáng)光，并計(jì)算熒光比值：RatioG/R=Fcell,em1/Fcell,em2

④以大腸桿菌懸液內(nèi)活細(xì)胞的占比為橫坐標(biāo)措施，以RatioG/R為縱坐標(biāo)示範推廣，制圖

六、流式細(xì)胞儀操作步驟：

儀器的檢測配置可能要因?qū)嶋H情況來調(diào)整，但此處列出的檢測技術(shù)和設(shè)置參數(shù)適用于市場上絕大多數(shù)流式細(xì)胞儀大大縮短。

6.1 調(diào)整大腸桿菌懸液（活和殺死）使其密度為1×108個(gè)細(xì)菌/ml（~0.03 OD670），之后用無菌dH2O稀釋100倍使其最終密度為1×106個(gè)細(xì)菌/ml開放要求。

6.2 參考表4在16×125mm高硼硅玻璃培養(yǎng)管內(nèi)混11種不同比例的細(xì)菌懸液高質量。每個(gè)樣本的總體積為2ml。

注意事項(xiàng)：

1由于試劑盒內(nèi)SYTO 9和PI的組分量少更高要求，室溫回溫充分融化后積極參與，務(wù)必低速離心沉至管底后再開蓋優勢領先。

2兩款探針溶液本身就是溶于DMSO中穩定發展，所以后續(xù)無需再單獨(dú)添加，第一次使用可將SYTO 9和PI根據(jù)單次用量分裝保存明顯，密封后置于≤-20℃避光保存更好。

3組分C（Mounting oil）主要應(yīng)用于熒光顯微鏡檢測法，菌液加到載玻片后基礎上，接著滴1-2滴組分C用于將細(xì)菌固定在膜上,25℃的折射率是517 ± 0.003安全鏈。不要用作浸油（Immersion oil）。

4SYTO 9和PI結(jié)合核酸預下達，PI是潛在的誘變劑增持能力，目前沒有數(shù)據(jù)闡明SYTO 9的誘變性或毒性，兩種試劑使用都需做恰當(dāng)防護(hù)創新為先。DMSO能促進(jìn)有機(jī)分子進(jìn)入組織提高鍛煉。強(qiáng)烈建議處理DMSO儲存液時(shí)戴雙層手套。對于核酸染料，含此類染料的試劑經(jīng)活性炭吸附后再進(jìn)行廢液處理進行培訓】破栈顒?；钚蕴恐蠼?jīng)焚燒來破壞染料。

5為了您的安全和健康關鍵技術，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作逐漸完善。