SYTO 9/PI 活細菌/死細菌雙染試劑盒產(chǎn)品簡介：

（SYTO 9/PI Live/Dead Bacterial Double Stain Kit）是一款方便且操作簡單的試劑盒服務效率，利用SYTO 9綠色核酸染料和碘化丙啶（PI）紅色熒光核酸染料來進行細菌活力的檢測不要畏懼，適用于大量的細菌種屬，包括蠟樣芽孢桿菌蓬勃發展、枯草芽孢桿菌作用、產(chǎn)氣莢膜桿菌、大腸桿菌落實落細、肺炎克雷伯氏菌意見征詢、草分枝桿菌、綠膿桿菌深入闡釋、Staphylococcus aureus集聚、奧拉尼堡沙門氏菌、宋內(nèi)志賀氏菌和化膿性鏈球菌大大提高。

SYTO 9/PI 活細菌/死細菌雙染試劑盒的工作原理在于：SYTO 9和PI的光譜特征以及穿透健康細菌細胞的能力不同新的動力。單獨使用時，SYTO 9能對群體內(nèi)的所有細菌進行標記—具有完整膜和受損膜的細菌調整推進；相反為產業發展，PI只能滲透進入受損的膜，PI的插入會引起SYTO 9染色熒光的降低發展契機，當(dāng)體系內(nèi)加入兩種染料時可以使用。因此，通過適量比例的SYTO 9和PI的混合染色，具有完整膜結(jié)構(gòu)的細菌呈綠色熒光廣泛認同，而具受損膜結(jié)構(gòu)的細菌呈紅色熒光進入當下。兩者染料的最大激發(fā)和發(fā)射波長分別是480/500nm（SYTO 9）和 490/635nm（PI）。背景基本無熒光服務好。本試劑盒兼容于熒光顯微鏡首次，熒光光度計、熒光酶標儀效高化、流式細胞儀或其它熒光檢測儀器生產效率。

產(chǎn)品組成：

【注】組分C熒光顯微鏡檢測方法中才會應(yīng)用的到，具體用法見注意事項3)部署安排。

試劑盒規(guī)格說明（按照建議的試劑稀釋倍數(shù)和單次測試體積來計算）：保存與運輸方法:-20℃避光保存競爭激烈，有效期一年。 冰袋運輸效果。

熒光顯微鏡檢測：1ml菌液加入3μl染料混合液（SYTO 1.5μl +PI 1.5μl）學習，可做40次獨立測試。

熒光酶標儀檢測：2ml無菌水加入12μl染料混合液（SYTO 6.0μl +PI 6.0μl）改善，制備成2×工作液。按照100μl染料混合液加入100μl菌液的比例使用，可做200次獨立測試推廣開來。

流式細胞儀檢測：2ml菌液加入6μl染料混合液（SYTO 3.0μl +PI 3.0μl）自行開發，可做20次獨立測試。

使用方法(以下步驟僅用作示例以指導(dǎo)科研人員開展自身細菌樣本的染色取得顯著成效。)

一處理方法、培養(yǎng)條件和細菌懸液的制備：

【注意】：用本試劑盒進行細菌染色，務(wù)必要小心去除培養(yǎng)基殘留責任，因為服務，核酸和其它培養(yǎng)基成分可能以不可預(yù)料的方式與SYTO 9和PI結(jié)合，導(dǎo)致染色結(jié)果發(fā)生不可接受的變動增多。簡單的一次清洗步驟通常足以去除培養(yǎng)基內(nèi)含的培養(yǎng)基成分干擾物殘留。不建議使用磷酸鹽清洗緩沖液，因此可能降低染色效率估算。

1.1 用營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)大腸桿菌或Staphylococcus aureus（30ml）使其生長至對數(shù)生長后期。

1.2 于10000×g離心10-15min達到，濃縮25ml細菌培養(yǎng)物深入各系統。

1.3 吸走上清液，用2ml 0.85% NaCl或適當(dāng)緩沖液來重懸沉淀的可能性。

1.4 取1ml重懸菌液分別加入含20ml 0.85% NaCl或適當(dāng)緩沖液的30-40ml離心管（設(shè)置為活細菌組）進一步推進，用含20ml 70%異丙醇（也可以用其他方法比如高熱處理殺死細菌）的30-40ml離心管（設(shè)置為死細菌組）。

1.5 兩管樣品（分別為活細菌組和死細菌組）于室溫孵育1h，每隔15min顛倒混勻一次明確相關要求。

1.6 兩管樣品（分別為活細菌組和死細菌組）于10000×g離心10-15min服務為一體。

1.7 用20ml 0.85% NaCl或適當(dāng)緩沖液重懸沉淀，并且按照步驟1.6再離心一次特點。

1.8 分別用10ml 0.85% NaCl或適當(dāng)緩沖液重懸兩管樣品相互配合。

1.9 分別取3ml菌液測定670nm的光密度（OD670），用玻璃或丙烯酸酯比色皿（1cm路徑）品質。

1.10 對于大腸桿菌或Staphylococcus aureus的建議染色濃度積極回應，根據(jù)你的儀器類型（熒光顯微鏡、熒光光度經(jīng)深化涉外、熒光酶標儀）或流式細胞儀來參考相應(yīng)部分的染色條件全會精神。

二、染色條件的優(yōu)化：

試劑盒內(nèi)的兩種染料都經(jīng)過平衡優(yōu)化又進了一步，按照1：1的比例進行混合用于絕大多數(shù)的樣本都能得到良好的區(qū)分活/死細菌智能化。偶然情況下，兩種染料的混合比例需根據(jù)實際需求進行優(yōu)化調(diào)整更默契了。比如：在待檢樣本中延伸，綠色熒光太突出，建議要么降低SYTO 9濃度要求，要么提高PI濃度。

為了全面優(yōu)化染色條件，建議測試梯度濃度的SYTO 9運行好，每一種濃度與梯度濃度的PI進行組合染色國際要求。建議按照1ml細菌懸液加入3µl不同混合比率的染料預(yù)混液。

[注]：SYTO 9 +PI 對細菌的染色請按照說明書建議的15min來操作同期，不要超過30min新趨勢。 SYTO 9有很好的細菌滲透性，我們給的實驗條件都是優(yōu)化過鍛造。 SYTO 9只有在哺乳動物細胞染色新體系，可能會延長染色時間到120min。

由于染的是活菌+死菌的比例共謀發展，請染色后盡快觀察搖籃，不要超過1h。 另創造，染色后基本是不用清洗的使用，除非覺得背景熒光很高，就是非細菌的菌體部分都能看到熒光，才有必要簡單清洗一次不難發現。

三合規意識、熒光顯微鏡操作步驟：

活菌和死菌的熒光可能用標準的熒光素長通濾片設(shè)置來同時觀察。替代方案的話推動，活菌（綠色熒光）和死菌（紅色熒光）可分別用熒光素和Texas Red帶通濾光片設(shè)置協調機製。用于本試劑盒檢測的建議熒光顯微鏡濾片設(shè)置見表1。

表1 適用于本試劑盒檢測用的常見濾光片特征：

3.1 在微量離心管內(nèi)組合等量的組分A（SYTO 9）和組分B（PI）充分發揮，混勻共享。

3.2 每1ml細菌懸液內(nèi)加入3μl染料預(yù)混液。按照建議的稀釋倍數(shù)全面展示，最終得到的染色工作液內(nèi)含0.3% DMSO姿勢。更高濃度的DMSO可能對染色產(chǎn)生副效果。

3.3 混勻后室溫避光孵育15min講理論。

3.4 吸5μl染色的細菌懸液到載玻片上有望，并蓋上18mm方形蓋玻片。

3.5 根據(jù)表1選擇熒光顯微鏡上合適的濾片來觀察解決問題。

四服務效率、熒光光度計操作步驟：

4.1 調(diào)整大腸桿菌懸液（活和殺死）使其密度為1×108個細菌/ml（~0.03 OD670）或Staphylococcus aureus懸液（活和殺死）使其密度為1×107個細菌/ml（~0.15 OD670）。用于熒光光度計檢測導向作用，Staphylococcus aureus懸液的濃度通常比大腸桿菌少10倍蓬勃發展。

4.2 參考表2在1cm 玻璃、丙烯酸酯或石英熒光比色皿混勻五種不同比例的細菌懸液重要意義。每個樣本的總體積為3ml問題。

4.3 在微量離心管內(nèi)分別加30μl組分A（SYTO 9）和30μl組分B（PI），混勻效率。

4.4 每組不同比例的細菌懸液內(nèi)加入9μl染料預(yù)混液（5個樣本×9μl =45μl總量），用槍上下吹打數(shù)次使其混勻。

4.5 室溫避光孵育15min十大行動。

4.6 熒光測定和數(shù)據(jù)分析：

①用熒光光度計測定每組細菌懸液（Fcell）的熒光發(fā)射光譜（激發(fā)：470nm重要性，發(fā)射：490-700nm）

②分別測定發(fā)射光譜在510-540nm（em1，綠色）和620-650nm（em2體系，紅色）的累積熒光系統穩定性，并計算累積熒光比值：RatioG/R=Fcell,em1/Fcell,em2

③以大腸桿菌懸液內(nèi)活細胞的占比為橫坐標，以累積綠色熒光與紅色熒光比（RatioG/R）為縱坐標平臺建設，制圖

五重要組成部分、熒光酶標儀操作步驟：

針對細菌懸液服務延伸，用熒光酶標儀的測定條件與熒光光度計的基本類似先進技術。如同熒光光度計的檢測步驟，染料濃度相同于熒光顯微鏡的建議濃度，綠/紅熒光比與活細菌相對數(shù)量呈正比合作。

5.1 調(diào)整大腸桿菌懸液（活和殺死）使其密度為2×108個細菌/ml（~0.06 OD670）或Staphylococcus aureus懸液（活和殺死）使其密度為2×107個細菌/ml（~0.3 OD670）具有重要意義。用于熒光酶標儀檢測，Staphylococcus aureus懸液的濃度通常比大腸桿菌少10倍。

5.2 參考表3在16×125mm高硼硅玻璃培養(yǎng)管內(nèi)混勻五種不同比例的細菌懸液（大腸桿菌或Staphylococcus aureus）勃勃生機。每個樣本的總體積為2ml。

5.3 在微量離心管內(nèi)分別加6μl組分A（SYTO 9）和6μl組分B（PI）宣講手段，混勻多種。

5.4 通過將所有的12μl上述預(yù)混液加入2ml無菌的dH2O，混勻后制備2×染色混合液競爭激烈。

5.5 吸100μl細菌懸液混合物到平底96孔板的各孔內(nèi)投入力度，建議每個制備物做三個平行。96孔板的邊緣孔通硨W習？罩靡员苊饧僮x數(shù)技術。

5.6 更換新的槍頭，每孔加入100μl 2×染色混合液，上下吹打使充分混勻結構重塑。

5.7 室溫避光孵育15min。

5.8 熒光測定和數(shù)據(jù)分析：

①以~485nm為激發(fā)波長空白區，~530nm為發(fā)射波長（emission 1貢獻法治，綠色）來測定每孔熒光

②以~485nm為激發(fā)波長，~630nm為發(fā)射波長（emission 2新的力量，紅色）來測定每孔熒光

③通過測定兩種發(fā)射波長下的熒光強光技術研究，并計算熒光比值：RatioG/R=Fcell,em1/Fcell,em2

④以大腸桿菌懸液內(nèi)活細胞的占比為橫坐標，以RatioG/R為縱坐標分享，制圖

六現場、流式細胞儀操作步驟：

儀器的檢測配置可能要因?qū)嶋H情況來調(diào)整，但此處列出的檢測技術(shù)和設(shè)置參數(shù)適用于市場上絕大多數(shù)流式細胞儀開展研究。

6.1 調(diào)整大腸桿菌懸液（活和殺死）使其密度為1×108個細菌/ml（~0.03 OD670）高質量，之后用無菌dH2O稀釋100倍使其最終密度為1×106個細菌/ml。

6.2 參考表4在16×125mm高硼硅玻璃培養(yǎng)管內(nèi)混11種不同比例的細菌懸液力量。每個樣本的總體積為2ml可靠。

注意事項：

1由于試劑盒內(nèi)SYTO 9和PI的組分量少，室溫回溫充分融化后方式之一，務(wù)必低速離心沉至管底后再開蓋我有所應。

2兩款探針溶液本身就是溶于DMSO中，所以后續(xù)無需再單獨添加首要任務，第一次使用可將SYTO 9和PI根據(jù)單次用量分裝保存管理，密封后置于≤-20℃避光保存新型儲能。

3組分C（Mounting oil）主要應(yīng)用于熒光顯微鏡檢測法，菌液加到載玻片后應用提升，接著滴1-2滴組分C用于將細菌固定在膜上,25℃的折射率是517 ± 0.003不同需求。不要用作浸油（Immersion oil）。

4SYTO 9和PI結(jié)合核酸新品技，PI是潛在的誘變劑品質，目前沒有數(shù)據(jù)闡明SYTO 9的誘變性或毒性，兩種試劑使用都需做恰當(dāng)防護慢體驗。DMSO能促進有機分子進入組織深化涉外。強烈建議處理DMSO儲存液時戴雙層手套。對于核酸染料左右，含此類染料的試劑經(jīng)活性炭吸附后再進行廢液處理向好態勢。活性炭之后經(jīng)焚燒來破壞染料創新科技。

5為了您的安全和健康更默契了，請穿實驗服并戴一次性手套操作。